Ⅰ 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶催化机理的初步探索

Ⅱ 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖合成的研究

文章摘自：《西北大学》 2011  廖娟  

【摘要】：甲基赤藓糖醇4-磷酸途径(2-methyl-D-erythritol 4-phosphate pathway, MEP pathway)是一条萜类化合物的生物合成途径。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate Synthase,DXS)是MEP途径中的第一个关键酶,它在硫胺素焦磷酸(ThPP, VB1)的帮助下催化丙酮酸与D-甘油醛-3-磷酸(D-Glyceraldehyde 3-phosphate, D-GAP)发生缩合反应形成MEP途径中的第一个重要中间体1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate, DXP); DXS还是某些细菌中合成ThPP和磷酸吡哆醇(VB6)的关键酶。DXP还原异构化酶(1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase, DXR)是MEP途径中的重要限速酶,也是筛选抗菌素和抗疟药物的一个重要靶标,目前对它的研究是该领域内的一个热点。作为DXR酶的天然底物,DXP对于研究DXR的催化机理和以DXR酶为靶标的抗菌素和抗疟药物的筛选是必需的。因此,对DXP合成方法学的研究也成为了一个热点。DXP的脱磷酸产物1-脱氧-D-木酮糖(1-Deoxy-D-xylulose,DX)虽然不是MEP途径中的直接中间体,但由于它可被植物及微生物体内的D-戊糖激酶(D-xylulokinsae)磷酸化形成DXP,因此它被看作是该途径中的一个潜在中间体。 目前DXP/DX的合成方法已有一些报道,但化学法合成DXP/DX过程复杂,大多数方法的产率很低,在5%-25%之间。而已有的酶法合成DXP/DX的方法简单,但是底物昂贵且稳定性差。本研究建立了一种新的以廉价、稳定、易得化合物为原料合成DXP以及DX的方法,同时还初步探讨了了DXS在催化DXP合成过程中的作用机理。 首先,本研究通过对工程菌种E. coli BL21(DE3)-DXS (EcDXS)和Rhodobacter capsulatus BL21(DE3)-DXS (RcDXS)扩大培养并大量诱导表达,并对表达得到的EcDXS和RcDXS进行亲和层析纯化、凝胶排阻层析纯化,得到了纯的EcDXS和RcDXS。利用这些纯的RcDXS和EcDXS,我们对DXS在催化DXP合成过程中的催化机理进行初步探讨 其次,我们根据文献报导的方法合成了DX,并成功摸索了DX的纯化方法。还建立并优化了一种新的化学法-酶法合成DXP/DX的方法,该方法包括以下步骤：1,R-glycidol在磷酸化试剂的作用下发生开环形成L-3-磷酸甘油；2,L-3-磷酸甘油在过氧化脱氢酶的作用下被磷酸甘油氧化酶氧化成磷酸二羟丙酮；3,磷酸二羟丙酮和丙酮酸钠在DXS以及其他物质的作用下生成DXP；4,DXP经过碱性磷酸酶酶切得到DX